2 × Pfu PCR -seos

A-1-malli

■ Malli sisältää proteiiniepäpuhtauksia tai Taq -estäjiä jne. - Puhdista DNA -templaatti, poista proteiiniepäpuhtaudet tai poista templaatin DNA puhdistussarjoilla.

■ Mallin denaturointi ei ole valmis — - Nosta denaturoitumislämpötilaa asianmukaisesti ja pidennä denaturointiaikaa.

■ Mallin huonontuminen-Valmistele malli uudelleen.

A-2 Pohjamaali

■ Alukkeiden huono laatu-syntetisoi aluke uudelleen.

■ Alukkeen hajoaminen —— Liuotetaan suuripitoiset alukkeet pieneen tilavuuteen säilyttämiseksi. Vältä moninkertaista jäätymistä ja sulamista tai pitkäaikaista 4 ° C: n kylmäsäilytystä.

■ Alukkeiden väärä suunnittelu (esim. Alukkeen pituus ei ole riittävä, dimeeri on muodostettu alukkeiden väliin jne.) -Suunnittele alukkeet uudelleen (vältä alukkeen dimeerin ja toissijaisen rakenteen muodostumista)

A-3 Mg²⁺keskittymistä

■ Mg²⁺ pitoisuus on liian alhainen —— Nosta Mg oikein²⁺ pitoisuus: Optimoi Mg²⁺ pitoisuus 1 - 3 mM: n reaktiosarjoilla 0,5 mM: n välein optimaalisen Mg: n määrittämiseksi²⁺ pitoisuus kullekin templaatille ja alukkeelle.

A-4 Hehkutuslämpötila

■ Korkea hehkutuslämpötila vaikuttaa pohjamaalin ja templaatin sitoutumiseen. - Pienennä hehkutuslämpötilaa ja optimoi tila 2 ° C: n gradientilla.

A-5 Jatkoaika

■ Lyhyt jatkoaika —— Pidennä pidennysaikaa.

Ilmiöt: Negatiiviset näytteet osoittavat myös kohdesekvenssikaistat.

A-1 PCR: n kontaminaatio

■ Kohdasekvenssin tai monistustuotteiden ristikontaminaatio - Älä varovasti pipetoimalla näytettä, joka sisältää kohdesekvenssin negatiiviseen näytteeseen, tai läikyttämästä niitä ulos sentrifugiputkesta. Reagenssit tai laitteet on autoklavoitava olemassa olevien nukleiinihappojen poistamiseksi, ja kontaminaation olemassaolo on määritettävä negatiivisilla kontrollikokeilla.

■ Reagenssien likaantuminen ——Aliquot reagenssit ja säilytä alhaisessa lämpötilassa.

A-2 Primer

■ Mg²⁺ pitoisuus on liian alhainen —— Nosta Mg oikein²⁺ pitoisuus: Optimoi Mg²⁺ pitoisuus 1 - 3 mM: n reaktiosarjoilla 0,5 mM: n välein optimaalisen Mg: n määrittämiseksi²⁺ pitoisuus kullekin templaatille ja alukkeelle.

■ Virheellinen alukemalli ja kohdesekvenssi on homologinen ei-kohdesekvenssin kanssa. —— Suunnittele alukkeet uudelleen.

Ilmiöt: PCR-monistuskaistat ovat ristiriidassa odotetun koon kanssa, joko suuria tai pieniä, tai joskus esiintyy sekä spesifisiä monistuskaistoja että epäspesifisiä monistuskaistoja.

A-1 Pohjamaali

■ Alukkeiden heikko spesifisyys

——Uudelleensuunnittele aluke.

■ Alukkeen pitoisuus on liian korkea —— Nosta denaturointilämpötilaa oikein ja pidennä denaturointiaikaa.

A-2 Mg²⁺ keskittymistä

■ Mg²⁺ pitoisuus on liian korkea —— Pienennä Mg2+ -pitoisuutta oikein: Optimoi Mg²⁺ pitoisuus 1 - 3 mM: n reaktiosarjoilla 0,5 mM: n välein optimaalisen Mg: n määrittämiseksi²⁺ pitoisuus kullekin templaatille ja alukkeelle.

A-3 Lämpöstabiili polymeraasi

■ Liiallinen entsyymimäärä - Vähennä entsyymimäärää asianmukaisesti 0,5 U: n välein.

A-4 Hehkutuslämpötila

■ Hehkutuslämpötila on liian alhainen —— Nosta lämpöä sopivasti tai ota käyttöön kaksivaiheinen hehkutusmenetelmä

A-5 PCR-sykliä

■ Liian monta PCR -sykliä - Vähennä PCR -syklien määrää.

A-1 Pohjamaali——Huono spesifisyys —— Suunnittele alusta uudelleen, muuta alukkeen sijaintia ja pituutta parantaaksesi sen spesifisyyttä; tai suorittaa sisäkkäisen PCR: n.

A-2-malli DNA

- - Malli ei ole puhdas - - Puhdista templaatti tai poista DNA puhdistussarjoilla.

A-3 Mg²⁺ keskittymistä

- Mg²⁺ pitoisuus on liian korkea - vähennä Mg -määrää oikein²⁺ pitoisuus: Optimoi Mg²⁺ pitoisuus 1 - 3 mM: n reaktiosarjoilla 0,5 mM: n välein optimaalisen Mg: n määrittämiseksi²⁺ pitoisuus kullekin templaatille ja alukkeelle.

A-4 dNTP

——DNTP: iden pitoisuus on liian korkea ——Pienennä dNTP: n pitoisuutta asianmukaisesti

A-5 Hehkutuslämpötila

——Liian alhainen hehkutuslämpötila ——Korota hehkutuslämpötila asianmukaisesti

A-6 sykliä

——Liian monta sykliä ——Optimoi syklin numero

Ensimmäinen askel on valita sopiva polymeraasi. Säännöllistä Taq-polymeraasia ei voida oikolukuuttaa 3'-5'-eksonukleaasiaktiivisuuden puutteen vuoksi, ja epäsuhta heikentää huomattavasti fragmenttien pidennystehokkuutta. Siksi tavallinen Taq -polymeraasi ei voi tehokkaasti monistaa kohdefragmentteja, jotka ovat suurempia kuin 5 kb. Taq -polymeraasi, jolla on erityinen muunnos tai muu korkean tarkkuuden polymeraasi, tulisi valita parantamaan laajentamisen tehokkuutta ja vastaamaan pitkän fragmentin monistamisen tarpeisiin. Lisäksi pitkien fragmenttien monistaminen edellyttää myös vastaavaa säätöä alukkeen rakenteesta, denaturointiajasta, pidennysajasta, puskurin pH: sta jne. Yleensä alukkeet, joilla on 18-24 emäsparia, voivat johtaa parempaan saantoon. Templaatin vaurioitumisen estämiseksi denaturointiaika 94 ° C: ssa on lyhennettävä 30 sekuntiin tai alle jaksoa kohden ja lämpötilan nousemisen 94 ° C: een ennen monistusta on oltava alle 1 minuutti. Lisäksi pidennyslämpötilan asettaminen noin 68 ° C: een ja pidennysajan suunnitteleminen nopeuden 1 kb/min mukaan voi varmistaa pitkien fragmenttien tehokkaan monistumisen.

PCR -monistuksen virhetasoa voidaan pienentää käyttämällä erilaisia ​​DNA -polymeraaseja erittäin tarkasti. Kaikkien tähän mennessä löydettyjen Taq DNA -polymeraasien joukossa Pfu -entsyymillä on alhaisin virhetaso ja suurin uskollisuus (katso oheinen taulukko). Entsyymivalinnan lisäksi tutkijat voivat edelleen vähentää PCR -mutaatiota optimoimalla reaktio -olosuhteita, mukaan lukien puskurikoostumuksen optimointi, lämpöstabiilin polymeraasin pitoisuus ja PCR -syklin lukumäärän optimointi.