Metylation-specipc PCR (MSP) -sarja

Metylaatiokohtainen PCR-tunnistuspakkaus.

Metylaatiospesifinen PCR (MSP) -sarja on kehitetty erityisesti asiakkaille, jotka tutkivat genomisen DNA: n metylaatio-ominaisuuksia PCR: llä, jossa MSP DNA Polymerase on termostabiili polymeraasi, joka on modifioitu vasta-aineilla, ja 10 × MSP PCR Buffer on PCR-puskuri, joka on optimoitu erityisesti MSP -reaktio. Se on yhteensopiva TIANGEN DNA -bisulfiittimuunnossarjan (4992447) kanssa.

Kissa. Ei Pakkauskoko
4992759 50 valmistusta

Tuotetiedot

Työnkulku

Kokeelliset esimerkit

Usein kysytyt kysymykset

Tuotetunnisteet

ominaisuudet

■ Tuotteen etuna on nopeus, yksinkertaisuus, korkea herkkyys, vahva spesifisyys ja hyvä vakaus.

Erittely

Tyyppi: MSP -DNA -polymeraasi
Sapluuna: <500 ng
Sovellukset: Se soveltuu metylaatiospesifiseen PCR (MSP) -menetelmään genomisen DNA: n metylaatio -ominaisuuksien analysoimiseksi

Kaikki tuotteet voidaan räätälöidä ODM/OEM: lle. Yksityiskohtia varten,napsauta Mukautettu palvelu (ODM/OEM)


  • Edellinen:
  • Seuraava:

  • product_certificate04 product_certificate01 product_certificate03 product_certificate02
    ×

    1. Metylaatiospesifistä PCR (MSP) -sarjaa käytettiin 400 emäsparin fragmentin monistamiseen käyttäen bisulfiittikäsitellyä genomista DNA: ta templaattina reaktiojärjestelmän ollessa 20 μl.

    Experimental Exampl

    2. PCR -reaktiosyklin asettaminen

    Experimental Exampl

     

    Experimental Examples 1: Toimittajan A käsittelemät näytteet;
    2: Toimittajan B käsittelemät näytteet;
    3: TIANGEN -käsitelty näyte 4: NTC; M: D2000
    Experimental Examples 1-6:
    6 toistoa;
    7: Toimittaja Käsitelty näyte;
    8: NTC; Bio2-F/R ja P16-Me-F/R: Kaksi tunnistusaluketta.
    K: Ei vahvistuskaistoja

    A-1-malli

    ■ Malli sisältää proteiiniepäpuhtauksia tai Taq -estäjiä jne. - Puhdista DNA -templaatti, poista proteiiniepäpuhtaudet tai poista templaatin DNA puhdistussarjoilla.

    ■ Mallin denaturointi ei ole valmis — - Nosta denaturoitumislämpötilaa asianmukaisesti ja pidennä denaturointiaikaa.

    ■ Mallin huonontuminen-Valmistele malli uudelleen.

    A-2 Pohjamaali

    ■ Alukkeiden huono laatu-syntetisoi aluke uudelleen.

    ■ Alukkeen hajoaminen —— Liuotetaan suuripitoiset alukkeet pieneen tilavuuteen säilyttämiseksi. Vältä moninkertaista jäätymistä ja sulamista tai pitkäaikaista 4 ° C: n kylmäsäilytystä.

    ■ Alukkeiden väärä suunnittelu (esim. Alukkeen pituus ei ole riittävä, dimeeri on muodostettu alukkeiden väliin jne.) -Suunnittele alukkeet uudelleen (vältä alukkeen dimeerin ja toissijaisen rakenteen muodostumista)

    A-3 Mg2+keskittymistä

    ■ Mg2+ pitoisuus on liian alhainen —— Nosta Mg oikein2+ pitoisuus: Optimoi Mg2+ pitoisuus 1 - 3 mM: n reaktiosarjoilla 0,5 mM: n välein optimaalisen Mg: n määrittämiseksi2+ pitoisuus kullekin templaatille ja alukkeelle.

    A-4 Hehkutuslämpötila

    ■ Korkea hehkutuslämpötila vaikuttaa pohjamaalin ja templaatin sitoutumiseen. - Pienennä hehkutuslämpötilaa ja optimoi tila 2 ° C: n gradientilla.

    A-5 Jatkoaika

    ■ Lyhyt jatkoaika —— Pidennä pidennysaikaa.

    K: Väärin positiivinen

    Ilmiöt: Negatiiviset näytteet osoittavat myös kohdesekvenssikaistat.

    A-1 PCR: n kontaminaatio

    ■ Kohdasekvenssin tai monistustuotteiden ristikontaminaatio - Älä varovasti pipetoimalla näytettä, joka sisältää kohdesekvenssin negatiiviseen näytteeseen, tai läikyttämästä niitä ulos sentrifugiputkesta. Reagenssit tai laitteet on autoklavoitava olemassa olevien nukleiinihappojen poistamiseksi, ja kontaminaation olemassaolo on määritettävä negatiivisilla kontrollikokeilla.

    ■ Reagenssien likaantuminen ——Aliquot reagenssit ja säilytä alhaisessa lämpötilassa.

    A-2 Primer

    ■ Mg2+ pitoisuus on liian alhainen —— Nosta Mg oikein2+ pitoisuus: Optimoi Mg2+ pitoisuus 1 - 3 mM: n reaktiosarjoilla 0,5 mM: n välein optimaalisen Mg: n määrittämiseksi2+ pitoisuus kullekin templaatille ja alukkeelle.

    ■ Virheellinen alukemalli ja kohdesekvenssi on homologinen ei-kohdesekvenssin kanssa. —— Suunnittele alukkeet uudelleen.

    K: Epäspesifinen vahvistus

    Ilmiöt: PCR-monistuskaistat ovat ristiriidassa odotetun koon kanssa, joko suuria tai pieniä, tai joskus esiintyy sekä spesifisiä monistuskaistoja että epäspesifisiä monistuskaistoja.

    A-1 Pohjamaali

    ■ Alukkeiden heikko spesifisyys

    ——Uudelleensuunnittele aluke.

    ■ Alukkeen pitoisuus on liian korkea —— Nosta denaturointilämpötilaa oikein ja pidennä denaturointiaikaa.

    A-2 Mg2+ keskittymistä

    ■ Mg2+ pitoisuus on liian korkea —— Pienennä Mg2+ -pitoisuutta oikein: Optimoi Mg2+ pitoisuus 1 - 3 mM: n reaktiosarjoilla 0,5 mM: n välein optimaalisen Mg: n määrittämiseksi2+ pitoisuus kullekin templaatille ja alukkeelle.

    A-3 Lämpöstabiili polymeraasi

    ■ Liiallinen entsyymimäärä - Vähennä entsyymimäärää asianmukaisesti 0,5 U: n välein.

    A-4 Hehkutuslämpötila

    ■ Hehkutuslämpötila on liian alhainen —— Nosta lämpöä sopivasti tai ota käyttöön kaksivaiheinen hehkutusmenetelmä

    A-5 PCR-sykliä

    ■ Liian monta PCR -sykliä - Vähennä PCR -syklien määrää.

    K: Laastarit tai tahrat

    A-1 Pohjamaali——Huono spesifisyys —— Suunnittele alusta uudelleen, muuta alukkeen sijaintia ja pituutta parantaaksesi sen spesifisyyttä; tai suorittaa sisäkkäisen PCR: n.

    A-2-malli DNA

    - - Malli ei ole puhdas - - Puhdista templaatti tai poista DNA puhdistussarjoilla.

    A-3 Mg2+ keskittymistä

    - Mg2+ pitoisuus on liian korkea - vähennä Mg -määrää oikein2+ pitoisuus: Optimoi Mg2+ pitoisuus 1 - 3 mM: n reaktiosarjoilla 0,5 mM: n välein optimaalisen Mg: n määrittämiseksi2+ pitoisuus kullekin templaatille ja alukkeelle.

    A-4 dNTP

    ——DNTP: iden pitoisuus on liian korkea ——Pienennä dNTP: n pitoisuutta asianmukaisesti

    A-5 Hehkutuslämpötila

    ——Liian alhainen hehkutuslämpötila ——Korota hehkutuslämpötila asianmukaisesti

    A-6 sykliä

    ——Liian monta sykliä ——Optimoi syklin numero

    K: Kuinka paljon templaatti -DNA: ta pitäisi lisätä 50 μl: n PCR -reaktiojärjestelmään?
    ytry
    K: Kuinka vahvistaa pitkiä fragmentteja?

    Ensimmäinen askel on valita sopiva polymeraasi. Säännöllistä Taq-polymeraasia ei voida oikolukuuttaa 3'-5'-eksonukleaasiaktiivisuuden puutteen vuoksi, ja epäsuhta heikentää huomattavasti fragmenttien pidennystehokkuutta. Siksi tavallinen Taq -polymeraasi ei voi tehokkaasti monistaa kohdefragmentteja, jotka ovat suurempia kuin 5 kb. Taq -polymeraasi, jolla on erityinen muunnos tai muu korkean tarkkuuden polymeraasi, tulisi valita parantamaan laajentamisen tehokkuutta ja vastaamaan pitkän fragmentin monistamisen tarpeisiin. Lisäksi pitkien fragmenttien monistaminen edellyttää myös vastaavaa säätöä alukkeen rakenteesta, denaturointiajasta, pidennysajasta, puskurin pH: sta jne. Yleensä alukkeet, joilla on 18-24 emäsparia, voivat johtaa parempaan saantoon. Templaatin vaurioitumisen estämiseksi denaturointiaika 94 ° C: ssa on lyhennettävä 30 sekuntiin tai alle jaksoa kohden ja lämpötilan nousemisen 94 ° C: een ennen monistusta on oltava alle 1 minuutti. Lisäksi pidennyslämpötilan asettaminen noin 68 ° C: een ja pidennysajan suunnitteleminen nopeuden 1 kb/min mukaan voi varmistaa pitkien fragmenttien tehokkaan monistumisen.

    K: Kuinka parantaa PCR: n vahvistustarkkuutta?

    PCR -monistuksen virhetasoa voidaan pienentää käyttämällä erilaisia ​​DNA -polymeraaseja erittäin tarkasti. Kaikkien tähän mennessä löydettyjen Taq DNA -polymeraasien joukossa Pfu -entsyymillä on alhaisin virhetaso ja suurin uskollisuus (katso oheinen taulukko). Entsyymivalinnan lisäksi tutkijat voivat edelleen vähentää PCR -mutaatiota optimoimalla reaktio -olosuhteita, mukaan lukien puskurikoostumuksen optimointi, lämpöstabiilin polymeraasin pitoisuus ja PCR -syklin lukumäärän optimointi.

    Kirjoita viestisi tähän ja lähetä se meille