Blood Direct PCR -sarja

Kohdegeenin nopea monistus suoraan käyttämällä verta mallina ilman uuttoa.

Tämä sarja sisältää geneettisesti muokatun anti-inhibiittorin DNA-polymeraasin monistamaan tehokkaasti yhden kopion geenit ihmisen genomissa. Tässä paketissa oleva hyvin optimoitu puskurijärjestelmä auttaa polymeraasia vastustamaan voimakkaasti PCR -estäjien estämistä ja voi siten monistaa suoraan DNA: ta käyttämällä verta ja viljeltyjä soluja templaateina. Tämä tuote on helppokäyttöinen eikä vaadi monimutkaisia vaiheita, kuten DNA: n puhdistusta tai näytteen esikäsittelyä.
Tämä sarja toimitetaan 2 × MasterMix -muodossa, ja reaktio voidaan suorittaa lisäämällä yksinkertaisesti verimalli ja vastaavat havaitsemisalukkeet. Sitä voidaan käyttää nisäkkäiden, kuten ihmisten, hiirien, sikojen, nautojen ja muiden lajien, viljellyille soluille sekä tuoreelle tai 4 ℃ kylmäsäilytetylle kokoverille, antikoagulantille (EDTA, sitraatti, hepariini), nesteytetyille verihyytymille ja kuiville veripisteille tallennettu Whatman 903- ja FTA Elute -kortteihin.

Kissa. Ei	Pakkauskoko
4992529	20 µl × 100 rxn
4992530	20 µl × 500 rxn

Lähetä meille sähköpostia

Tuotetiedot

Kokeellinen esimerkki

Usein kysytyt kysymykset

Tuotetunnisteet

ominaisuudet

■ Yksinkertaista ja nopeaa: PCR -monistus voidaan suorittaa suoraan käyttämällä verta mallina ilman, että näytteen valmisteluun ja DNA: n erottamiseen vaaditaan tylsiä vaiheita.
■ Erittäin puhdas: Näytteiden esikäsittely- ja DNA-uuttovaiheiden ohittaminen voi auttaa välttämään näytteiden ristikontaminaatiota.
■ Suuri suorituskyky: Suurten näytteiden PCR-tunnistus voidaan tehdä yhdistämällä sarja 96/384-kuoppaisiin PCR-levyihin.
■ Vahva yleismaailmallisuus: Tämä sarja voi tehokkaasti monistaa korkean GC -fragmentin tai monimutkaisen toissijaisen rakenteen fragmentteja, ja vahvistuspituus voi olla jopa 5 kb.
■ Vahva stressinkestävyys: Tätä sarjaa voidaan käyttää eri lajeille ja eri tavoin säilytetyille verinäytteille.

Sovellukset

Tämän sarjan PCR-tuotteet sisältävät 3'-päässä "A", jota voidaan käyttää suoraan TA-vektorikloonaukseen. Tätä sarjaa voidaan käyttää genomisten DNA-fragmenttien monistamiseen, korkean suorituskyvyn geneettiseen analyysiin ja genotyypin määrittämiseen (kuten geenin havaitsemiseen).

Kaikki tuotteet voidaan räätälöidä ODM/OEM: lle. Yksityiskohtia varten,napsauta Mukautettu palvelu (ODM/OEM)

Edellinen: TIANcombi DNA Lyse & Det PCR -sarja

Seuraava: Hiiren kudos suora PCR -sarja

	Käyttämällä ihmisen EDTA -antikoagulaatiota templaattina, 4 geeniä, joilla oli erilainen GC -pitoisuus, monistettiin Blood Direct PCR -sarjalla. PCR -reaktiojärjestelmä oli 20 μl, ja templaattina käytettiin 1 μl verta. M: TIANGEN Marker II; 1: Fragmentin koko 1090 bp, GC -pitoisuus 68,1%; 2: Fragmentin koko 1915 bp, GC -pitoisuus 70,4%; 3: Fragmentin koko 448 bp, GC -pitoisuus 74,8%; 4: Fragmentin koko 1527 bp, GC -pitoisuus 61,5%. Kokeelliset tulokset: Blood Direct PCR Kit voi tehokkaasti monistaa DNA-fragmentteja, joiden GC-pitoisuus on välillä 61,5%-74,8%, mikä viittaa siihen, että se pystyy monistamaan korkean GC-fragmentit.
	Käyttämällä ihmisen EDTA -antikoagulaatiota templaattina, 5 eri pituista geeniä (ActB, Prp, DN1.0, Hn2.0 ja Hn4.0) monistettiin Blood Direct PCR Kit -sarjalla. PCR -reaktiojärjestelmä oli 20 μl, ja templaattina käytettiin 1 μl verta. M: TIANGEN Marker II; 1-3: 3 erilaista verinäytettä; NTC: ohjaus ilman alukkeita. Kokeelliset tulokset: Blood Direct PCR Kit voi monistaa jopa 4 kb: n pituisia fragmentteja, mikä viittaa siihen, että se pystyy monistamaan pitkiä fragmentteja.
	Käyttämällä ihmisen EDTA -antikoagulaatiota mallina Blood Direct PCR Kit -laitetta käytettiin eri verinäytteiden PCR -havaitsemiseen. PCR -reaktiojärjestelmä oli 20 μl, ja templaattina käytettiin 1 μl verta. M: TIANGEN Marker II; 1-9: veren latausmäärä on 0,1 μl, 0,2 μl, 0,3 μl, 0,4 μl, 1 μl, 2 μl, 3 μl, 4 μl ja 5 μl, vastaavasti; NTC: ohjaus ilman mallia Kokeelliset tulokset: Blood Direct PCR -sarjalla on vahva vastustuskyky verille ja se voi monistaa verinäytteitä 0,1-5 μl: n latausalueella.
	Mallina käytettiin verinäytteitä ihmisiltä, rotilta, kanoilta ja muilta lajeilta erilaisilla käsittelyillä. Blood Direct PCR -sarjaa käytettiin PRNP: n (ihmisen, 750 bp), aktiinin (rotta, 200 bp) ja β-aktiinin (kana, 1,0 kb) monistamiseen. PCR -reaktiojärjestelmä oli 20 μl, ja templaattina käytettiin 1 μl verta. M: TIANGEN Marker II. Kokeelliset tulokset: Blood Direct PCR -sarjaa voidaan käyttää monenlaisissa näytteissä, ja suora PCR -tunnistus voidaan suorittaa eri lajien verinäytteistä erilaisilla hoidoilla.

K: Ei vahvistuskaistoja

A-1-malli

■ Malli sisältää proteiiniepäpuhtauksia tai Taq -estäjiä jne. - Puhdista DNA -templaatti, poista proteiiniepäpuhtaudet tai poista templaatin DNA puhdistussarjoilla.

■ Mallin denaturointi ei ole valmis — - Nosta denaturoitumislämpötilaa asianmukaisesti ja pidennä denaturointiaikaa.

■ Mallin huonontuminen-Valmistele malli uudelleen.

A-2 Pohjamaali

■ Alukkeiden huono laatu-syntetisoi aluke uudelleen.

■ Alukkeen hajoaminen —— Liuotetaan suuripitoiset alukkeet pieneen tilavuuteen säilyttämiseksi. Vältä moninkertaista jäätymistä ja sulamista tai pitkäaikaista 4 ° C: n kylmäsäilytystä.

■ Alukkeiden väärä suunnittelu (esim. Alukkeen pituus ei ole riittävä, dimeeri on muodostettu alukkeiden väliin jne.) -Suunnittele alukkeet uudelleen (vältä alukkeen dimeerin ja toissijaisen rakenteen muodostumista)

A-3 Mg²⁺keskittymistä

■ Mg²⁺ pitoisuus on liian alhainen —— Nosta Mg oikein²⁺pitoisuus: Optimoi Mg²⁺ pitoisuus 1 - 3 mM: n reaktiosarjoilla 0,5 mM: n välein optimaalisen Mg: n määrittämiseksi²⁺ pitoisuus kullekin templaatille ja alukkeelle.

A-4 Hehkutuslämpötila

■ Korkea hehkutuslämpötila vaikuttaa pohjamaalin ja templaatin sitoutumiseen. - Pienennä hehkutuslämpötilaa ja optimoi tila 2 ° C: n gradientilla.

A-5 Jatkoaika

■ Lyhyt jatkoaika —— Pidennä pidennysaikaa.

K: Väärin positiivinen

Ilmiöt: Negatiiviset näytteet osoittavat myös kohdesekvenssikaistat.

A-1 PCR: n kontaminaatio

■ Kohdasekvenssin tai monistustuotteiden ristikontaminaatio - Älä varovasti pipetoimalla näytettä, joka sisältää kohdesekvenssin negatiiviseen näytteeseen, tai läikyttämästä niitä ulos sentrifugiputkesta. Reagenssit tai laitteet on autoklavoitava olemassa olevien nukleiinihappojen poistamiseksi, ja kontaminaation olemassaolo on määritettävä negatiivisilla kontrollikokeilla.

■ Reagenssien likaantuminen ——Aliquot reagenssit ja säilytä alhaisessa lämpötilassa.

A-2 Primer

■ Mg²⁺ pitoisuus on liian alhainen —— Nosta Mg oikein²⁺ pitoisuus: Optimoi Mg²⁺ pitoisuus 1 - 3 mM: n reaktiosarjoilla 0,5 mM: n välein optimaalisen Mg: n määrittämiseksi²⁺ pitoisuus kullekin templaatille ja alukkeelle.

■ Virheellinen alukemalli ja kohdesekvenssi on homologinen ei-kohdesekvenssin kanssa. —— Suunnittele alukkeet uudelleen.

K: Epäspesifinen vahvistus

Ilmiöt: PCR-monistuskaistat ovat ristiriidassa odotetun koon kanssa, joko suuria tai pieniä, tai joskus esiintyy sekä spesifisiä monistuskaistoja että epäspesifisiä monistuskaistoja.

A-1 Pohjamaali

■ Alukkeiden heikko spesifisyys

——Uudelleensuunnittele aluke.

■ Alukkeen pitoisuus on liian korkea —— Nosta denaturointilämpötilaa oikein ja pidennä denaturointiaikaa.

A-2 Mg²⁺ keskittymistä

■ Mg²⁺ pitoisuus on liian korkea —— Pienennä Mg2+ -pitoisuutta oikein: Optimoi Mg²⁺ pitoisuus 1 - 3 mM: n reaktiosarjoilla 0,5 mM: n välein optimaalisen Mg: n määrittämiseksi²⁺ pitoisuus kullekin templaatille ja alukkeelle.

A-3 Lämpöstabiili polymeraasi

■ Liiallinen entsyymimäärä - Vähennä entsyymimäärää asianmukaisesti 0,5 U: n välein.

A-4 Hehkutuslämpötila

■ Hehkutuslämpötila on liian alhainen —— Nosta lämpöä sopivasti tai ota käyttöön kaksivaiheinen hehkutusmenetelmä

A-5 PCR-sykliä

■ Liian monta PCR -sykliä - Vähennä PCR -syklien määrää.

K: Laastarit tai tahrat

A-1 Pohjamaali——Huono spesifisyys —— Suunnittele alusta uudelleen, muuta alukkeen sijaintia ja pituutta parantaaksesi sen spesifisyyttä; tai suorittaa sisäkkäisen PCR: n.

A-2-malli DNA

- - Malli ei ole puhdas - - Puhdista templaatti tai poista DNA puhdistussarjoilla.

A-3 Mg²⁺ keskittymistä

- Mg²⁺ pitoisuus on liian korkea - vähennä Mg -määrää oikein²⁺ pitoisuus: Optimoi Mg²⁺ pitoisuus 1 - 3 mM: n reaktiosarjoilla 0,5 mM: n välein optimaalisen Mg: n määrittämiseksi²⁺ pitoisuus kullekin templaatille ja alukkeelle.

A-4 dNTP

——DNTP: iden pitoisuus on liian korkea ——Pienennä dNTP: n pitoisuutta asianmukaisesti

A-5 Hehkutuslämpötila

——Liian alhainen hehkutuslämpötila ——Korota hehkutuslämpötila asianmukaisesti

A-6 sykliä

——Liian monta sykliä ——Optimoi syklin numero

K: Kuinka paljon templaatti -DNA: ta pitäisi lisätä 50 μl: n PCR -reaktiojärjestelmään?

K: Kuinka vahvistaa pitkiä fragmentteja?

Ensimmäinen askel on valita sopiva polymeraasi. Säännöllistä Taq-polymeraasia ei voida oikolukuuttaa 3'-5'-eksonukleaasiaktiivisuuden puutteen vuoksi, ja epäsuhta heikentää huomattavasti fragmenttien pidennystehokkuutta. Siksi tavallinen Taq -polymeraasi ei voi tehokkaasti monistaa kohdefragmentteja, jotka ovat suurempia kuin 5 kb. Taq -polymeraasi, jolla on erityinen muunnos tai muu korkean tarkkuuden polymeraasi, tulisi valita parantamaan laajentamisen tehokkuutta ja vastaamaan pitkän fragmentin monistamisen tarpeisiin. Lisäksi pitkien fragmenttien monistaminen edellyttää myös vastaavaa säätöä alukkeen rakenteesta, denaturointiajasta, pidennysajasta, puskurin pH: sta jne. Yleensä alukkeet, joilla on 18-24 emäsparia, voivat johtaa parempaan saantoon. Templaatin vaurioitumisen estämiseksi denaturointiaika 94 ° C: ssa on lyhennettävä 30 sekuntiin tai alle jaksoa kohden ja lämpötilan nousemisen 94 ° C: een ennen monistusta on oltava alle 1 minuutti. Lisäksi pidennyslämpötilan asettaminen noin 68 ° C: een ja pidennysajan suunnitteleminen nopeuden 1 kb/min mukaan voi varmistaa pitkien fragmenttien tehokkaan monistumisen.

K: Kuinka parantaa PCR: n vahvistustarkkuutta?

PCR -monistuksen virhetasoa voidaan pienentää käyttämällä erilaisia DNA -polymeraaseja erittäin tarkasti. Kaikkien tähän mennessä löydettyjen Taq DNA -polymeraasien joukossa Pfu -entsyymillä on alhaisin virhetaso ja suurin uskollisuus (katso oheinen taulukko). Entsyymivalinnan lisäksi tutkijat voivat edelleen vähentää PCR -mutaatiota optimoimalla reaktio -olosuhteita, mukaan lukien puskurikoostumuksen optimointi, lämpöstabiilin polymeraasin pitoisuus ja PCR -syklin lukumäärän optimointi.

Kirjoita viestisi tähän ja lähetä se meille